ATP-Synthasen

ATPasen aus halophilen Archaea sind im Vergleich zu den F- ATPasen der Pflanzen noch relativ unerforscht. Genauere Kenntnisse über Funktion und Struktur dieser Enzyme tragen nicht nur zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen zwischen Bacteria, Archaea und Eukarya bei, sondern eröffnen auch neue Möglichkeiten, Erkenntnisse über das Wesen der Halophilie zu gewinnen. Archaebakterien-ATPasen besitzen größere Ähnlichkeit zu den Vakuolen-ATPasen der Eukaryonten als zu den F-ATPasen der Eubakterien. Haloferax volcanii und Haloferax mediterranei, beides halophile Archaea, besitzen ATP-Synthasen, an denen man, sorgt man für einen ausreichenden Protonengradienten, ATP-Synthese messen kann. Aus der Membran isoliert, hydrolysieren diese Enzyme unter geeigneten Bedingungen (hohe NaCl-Konzentrationen, Anwesenheit von Mg²⁺ oder Mn²⁺, Temperaturen zwischen 40 und 60 Grad Celsius) ATP zu ADP und Phosphat.

Wir haben die optimalen Bedingungen für diese ATPase-Aktivitäten  für beide Bakterienstämme charakterisiert. Haloferax mediterranei wurde in Zusammenarbeit mit dem Mikrobiologischen Institut der Universität Alicante untersucht. Das Enzym wurde isoliert, gereinigt und die großen Untereinheiten A und B mit Hilfe von Antikörpern gegen andere ATPasen identifiziert.

Zur Isolierung und Aufreinigung des Enzyms aus Haloferax volcanii wurden verschiedene Solubilisierungs - und Fällungsmethoden getestet. Trotz der, bei allen Reinigungsschritten notwendigen, sehr hohen NaCl-Konzentration (ca. 2 Mol/l) führten die Versuche zum gewünschten Erfolg. Gelfiltration über HPLC führte zur Molekulargewichtsbestimmung des Komplexes und Auftrennung des gereinigten Proteins über SDS-Gelelektrophorese sowie anschließende Immundetektion zur Identifizierung von zugehörigen Untereinheiten. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden publiziert. Dieser Teil unserer Forschung wurde mit Sachmitteln des Sonderforschungsbereichs 189, Projekt B10 "Charakterisierung von Archaebakterien-ATPasen im Vergleich mit der Chloroplasten-ATPase" und mit Gastmitteln für einen Gastaufenthalt von Frau Dane von der DFG gefördert.

Molekulare Charakterisierung der ATPase aus dem Archaebakterium Haloferax volcanii

Im molekularbiologischen Ansatz erhielten wir nach Einsatz einer Sonde, die nach einem bekannten, hoch konservierten Sequenzstück anderer ATPasen synthetisiert wurde, durch Polymerase-Kettenreaktion je eine etwa 450 Basenpaare große Teilsequenz aus dem Gen für die A- und B-Untereinheit des Enzyms. Diese zentralen Stücke konnten mit den Sequenzen aus anderen Organismen verglichen werden und zeigen eine größere Übereinstimmung mit den eukaryontischen Vakuolen-ATPasen als mit den F-ATPasen. Danach erfolgte die Sequenzierung der gesamten Gene für die A-Untereinheit und für die B-Untereinheit. Die halophilen Proteine enthalten 20% saure Aminosäuren, etwa doppelt so viele wie in nicht halophilen Proteinen vorhanden sind.

In ihrer Dissertation sequenzierte und charakterisierte Frau Steinert ein Operon für den A1-Teil der halophilen ATPase (Untereinheiten: D, C, E, A, B). Dieses Operon besitzt erstaunlicherweise wenig Ähnlichkeit mit dem einzigen bisher bekannten ATPase - Operon eines acidothermophilen Archaeons (Sulfolobus acidocaldarius). Es ist das erste bisher bekannte ATPase-Operon aus einem halophilen Archaebakterium. Diese Arbeiten wurden von Frau Dr. Kerstin Steinert durchgeführt, die für die Zeit ihrer Doktorarbeit Stipendiatin des Landes NRW war und ihre Dissertation mit Auszeichnung abgeschlossen hat. Die Ergebnisse aus den Untersuchungen der Haloferax volcanii ATP-Synthase führten zu einem Modell, das sich in der Stöchiometrie seiner Untereinheiten an die F-ATPasen anlehnt.

A₀-Teil (Protonenkanal) der Archaea-ATPasen

Es gibt bisher keine Daten über den membranständigen Teil der halophilen ATPasen (A₀), den wir deshalb an Haloferax volcanii aufklären möchten. Zunächst haben wir uns daher mit dem Proteolipid oder Untereinheit c des A₀-Teils beschäftigt. Dieses lipophile Protein ist am Protonentransport durch die Membran beteiligt. Bei Vakuolen-ATPasen von Eukaryonten ist diese Untereinheit infolge einer Gen-Duplikation doppelt so groß wie bei F-ATPasen. Mit Hilfe der Gelelektrophorese haben wir eine Größe von 9.7 kDa für die Untereinheit c der Haloferax volcanii-ATPase ermittelt. Die N-terminale Aminosäuresequenz läßt einen Vergleich mit dem Proteolipid der Chloroplasten-ATPase zu. Wir wollen die gereinigte Untereinheit mit Hilfe von Proteasen spalten und den mittleren, besser konservierten Bereich der Sequenz ermitteln. Erste Ansätze dazu wurden von Herrn Dipl. Biol. Gereon Lauer in seiner Diplomarbeit durchgeführt. Aus diesen Kenntnissen soll eine Sonde für die anschließend durchzuführende Polymerase-Kettenreaktion entstehen. Da anzunehmen ist, daß auch in den A-ATPasen mehrere membranintegrale Untereinheiten vorhanden sind, ist unser Ziel, diese in Zukunft sowohl biochemisch als auch molekularbiologisch zu charakterisieren.

Nitratreduktase aus Haloferax volcanii

Wenn Haloferax volcanii bei Anwesenheit von Nitrat im Medium anaerob gezogen und dabei weiter belichtet wird, wird eine Nitratreduktase als dissimilatorischer Endakzeptor induziert. Die Bedingungen für das Auftreten dieses Enzyms sowie die optimalen Bedingungen für die Nitritbildung wurden genauer untersucht. Im Unterschied zur ATPase ist dieses Enzym nicht salzabhängig. Es verliert seine Aktivität nicht, wenn es in normalen NaCl-Konzentrationen untersucht wird. Die Aufreinigung und Charakterisierung der Nitratreduktase war Thema einer Diplomarbeit. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind zum Teil publiziert. Weiterhin geplant sind die molekularbiologische Charakterisierung der Sequenzen der Nitratreduktase und ein Vergleich der Struktur mit der des salzabhängigen Enzyms aus Haloferax mediterranei. Salzabhängige Enzyme weisen immer einen hohen Anteil (etwa 20%) an sauren Aminosäuren auf, von denen angenommen wird, daß sie negativ geladene "Cluster" bilden, die in der Zelle durch positiv geladene Ionen abgeschirmt werden müssen, damit das Enzym in seiner nativen Konformation bleibt. Wieso es in den gleichen halophilen Organismen auch nicht-salzabhängige Proteine gibt, und wie sich diese vor Denaturierung durch hohe Ionenkonzentration und Mangel an freiem Wasser schützen, ist bisher nicht bekannt. Es scheint aber so zu sein, daß Enzyme, die sich im periplasmatischen Raum befinden, andere Schutzmöglichkeiten besitzen. Vergleiche der Sequenzen der beschriebenen Nitratreduktase aus dem periplasmatischen Raum von Haloferax volcanii mit den bereits bekannten aus Eubakterien sollen darüberhinaus zu verwandtschaftlichen Beziehungen aufklärend beitragen.